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技术专区 教您如何建PCR实验室

2009/2/3/09:47 来源:现代实验室装备网

    为了对以个特定序列进行PCR做重复检测,需要三个不同的区域,每一个区域的具体技术操作和试剂在下面详细列出.

    1、样品准备区

    这个区域专门用作样品的准备,在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取预防措施:

    1)PCR产物和带有要扩增序列的DNA克隆不能在这个房间操作。

    2)组织培养物、组织标本和血清样品都带进样品准备间处理,以根据应用的需要提取DNA或RNA。

    3)用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具,也不能用作操作靶序列。

    4)DNA样品应该用有专门的防护或正压活塞式移液管操作,以防止在吸取样品时有气溶胶遗留。

    5)大体积样品应该用单独包装的无菌一次性移液管吸取。

    6)管子打开前都要简短离心以减少气溶胶的产生,而且管子不能用力崩开,这样会产生气溶胶。

    7)任何时候都应该穿实验服和带手套,手套要经常更换,尤其在抽提过程中每一步之间都要更换。实验服要专门用于样品准备间,经常清洗。

    2、样品准备和RNA-PCR

    RNA-PCR的额外步骤需要额外的样品操作,这样增加了样品之间污染的机会。为了避免这一问题,反转录一步可以在样品准备区进行。在RNA-PCR中应用UNG以防止污染的方法也有报道。

    3、前PCR区

    必须有专门用于准备各种反应的区域,这个区域必须保持干净,而且没有来自克隆和样品准备的污染。前PCR区必须要有试剂和准备,特别是专门用于前PCR区的正压活塞式移液管。

    4、PCR实验室试剂的操作

    1)所用的所有溶液都应该没有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。

    2)所有PCR试剂中使用的水都应该是高质量的-新鲜蒸馏的去离子水,用0.22μm过滤的,并且是高压灭菌。

    3)在20℃到25℃贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂,在扩增试剂或样品制备试剂中加入0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应。

    4)所用试剂都应该以大体积配制,实验一下看试剂是否满意,然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。

    5)所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子。

    6)新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。

    7)样品准备和前PCR区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。

    5、在前PCR区建立PCR混合物

    1)可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分装并保存在-20℃或4℃,在实验室只涉及到扩增一种或少数几种特异序列时这样做很有用。

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